재조합단백질의 미량정량은 지금까지 유일하게 세계적으로 1976년에 개발된 단백질에 대한 높은 결합력을 가진 색소인 쿠마시브릴리안트청 G-250을 리용하여 진행되여왔다. 단백질의 미량정량은 재조합단백질의 제조만이 아니라 림상생화학적진단을 비롯한 의학과 생물학의 다른 여러 부문에서도 절실히 요구되고있다.
색소결합법에 의한 단백질의 정량방법으로는 원심분리기나 전기영동장치, 자외선분광광도계와 같은 기구를 쓰지 않으면서 적은 량의 단백질을 용액상태에서 짧은 시간동안에 간단한 조작으로 직접 정량할수 있다.
우리 나라에서는 여러가지 생물활성단백질들을 생물공학적방법으로 제조하기 위한 연구들이 진행되여 이미 사람성장호르몬, 사람인터페론α2b 등이 상품으로 실현되였으며 에리트로포에틴, 사람안기오스타틴, 사람티모진, 알부민융합사람성장호르몬을 비롯한 여러가지 재조합단백질들의 제조에 관한 연구가 활발히 진행되고있다. 이로부터 재조합단백질제조의 각이한 단계에서 단백질농도가 대단히 낮은 용액으로부터 단백질농도를 결정하고 적은 시료로 전기영동분석하는것은 현실적으로 중요한 문제로 제기된다.
우리 나라에서는 현재 재조합단백질의 미량정량을 전적으로 수입시약인 쿠마시브릴리안트청 G-250으로 진행하고있으며 단백질농도가 대단히 낮은 용액에 들어있는 미량의 단백질을 회수하기 위한 방법은 아직까지 연구되지 않았다.
따라서 연구집단은 우리 나라에서 생산되고있는 니그로신으로 농도가 대단히 낮은 재조합단백질용액에서 단백질의 농도를 직접 측정하며 미량의 단백질을 침전회수하기 위한 방법을 확립하기 위한 연구사업을 진행하여 그 방법을 확립하였다.
0.01% 니그로신용액 1mL에 2mg/mL의 재조합사람성장호르몬 0.1mL를 첨가하였을 때 반응혼합물의 흡광도는 577nm에서 가장 높았다.(쿠마시브릴리안트청 G-250의 흡광도는 595nm에서 가장 높았다.)
니그로신을 2% 삼염화초산에 0.01%로 포함되게 시료와 혼합한 후 4min후에 577nm에서 흡광도를 측정하여 3～5 000㎍/mL범위의 단백질을 정량할수 있었다.
니그로신으로 단백질을 정량하는데 안전한 pH범위는 3～9이며 단백질의 종류에 따르는 측정값의 차이는 도데실류산나트리움(SDS)을 0.03%로 첨가하여 극복할수 있었다. 니그로신은 쿠마시브릴리안트청 G-250법과 믿음도가 거의 완전히 같았고(r=0.999) 재현성이 높았다.(동시재현성 CV<4.6％, 일간재현성 CV<5.1％)
10~100㎍/mL의 재조합사람성장호르몬용액 1mL에 0.03％ 니그로신용액 0.5mL를 첨가하고 10 000회/min에서 10mim 원심분리한 후 침사를 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기영동하였을 때 모든 용액의 침사들에서 단백질이 나타났다. 니그로신으로 침전하기전의 용액에서는 20㎍/mL이상의 단백질농도를 가진 시료들에서만 전기영동후 단백질이 검출되였다.
우리는 니그로신으로 침전회수할수 있는 단백질용액의 최소농도를 결정하였다. 결과 니그로신으로 최소 3㎍/mL의 단백질용액으로부터 재조합단백질을 침전회수하여 전기영동검출할수 있었다.
앞으로 우리는 생물활성단백질들을 생물공학적방법으로 제조하는 연구단위들과 오줌속의 미량단백질정량을 비롯한 림상생화학적진단에 이 방법을 도입하려고 한다.
