《과학자, 기술자들은 하면 된다는 신심과 기어이 첨단을 돌파하여 세계를 디디고 올라서겠다는 각오를 가지고 자기 부문에서 첨단수준을 돌파하기 위한 목표를 높이 세우고 힘차게 투쟁해나가야 합니다.》 (
세계적으로 재조합단백질발현숙주로 널리 리용되는 대장균에서 체외발현을 실현하기 위한 여러가지 방법들이 연구되고있다.
우리는 대장균피타제유전자 appA(GenBank 등록번호 KT731135)의 자체신호배렬을 리용하여 체외분비형발현을 실현하기 위한 연구를 진행하였다.
대장균발현계에서 목적산물의 분비형발현을 실현하기 위하여 일반적으로 리용되는 신호배렬로서는 OmpA와 PelB신호배렬을 들수 있다. 우리는 AppA의 성숙펩티드의 앞부분에 자체신호배렬과 OmpA, PelB신호배렬들을 융합시킨 재조합발현운반체를 제작하였다. 자체신호배렬과 OmpA신호배렬이 융합된 배렬들은 제한효소 NdeI와 HindIII을 리용하여 pET30a(+)운반체에 방향성삽입시켰다. pET22b(+)에 appA의 성숙펩티드암호화배렬을 제한효소 NcoI와 HindIII을 리용하여 방향성삽입시켜 PelB신호배렬이 N-말단에 융합되도록 하였다.
제작된 재조합발현운반체들을 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시키고 재조합피타제의 발현특성을 비교하였다. 하루밤동안 배양한 재조합균그루를 1% 되게 LB배지에 접종하고 37℃, 200rpm에서 약 4h동안 초기배양을 진행한 다음 8mmol/L의 젖당으로 25℃, 200rpm에서 약 10h동안 유도한 후 배양상청의 피타제활성을 비교한 결과 자체신호배렬을 리용한 발현계에서 27.5U/mL로 가장 높으며 다음 PelB와 OmpA신호배렬을 리용한 발현계에서는 각각 12.8U/mL, 6.2U/mL로 적다.
자체신호배렬을 리용한 발현계에서 재조합피타제의 체외분비형발현에 미치는 몇가지 배양조건들의 영향을 검토하여 합리적인 조건을 확증하였다. 분비형재조합발현숙주의 발현량과 그중 배양상청액에 분비되는 분량을 늘이기 위해서는 종균배양시간을 12h, 유도제인 젖당의 농도를 8mmol/L, 유도온도를 19℃로 보장해주는것이 유리하다. 이때 유도 16h만에 배양상청액의 피타제활성은 91.5U/mL이고 이것은 전체 재조합피타제활성의 86.0%에 해당한것이다.
대장균에서 pET계렬의 운반체를 리용하여 kil유전자를 공발현시키면서 대장균피타제를 분비형으로 발현시킨 실례를 비롯하여 체외분비형발현을 위한 여러가지가 연구가 보고되였으나 TB배지에서 IPTG유도 30h만에 50U/mL의 피타제를 분비시킨것이 가장 높은 수준이였다. 이와 비교할 때 자체신호배렬을 리용한 체외분비형발현이 배양기원가나 유도시간, 효소활성 등의 측면에서 우월하다고 본다.
