《정보산업, 나노산업, 생물산업과 같은 첨단기술산업을 대대적으로 창설하여 나라의 경제발전에서 첨단기술산업이 차지하는 비중과 중추적역할을 높여나가야 합니다.》
인슐린양성장인자-1(insulin like growth factor-1, IGF-1)은 성장호르몬의 작용을 매개하는 중요한 생물활성물질로서 유기체의 성장발육뿐아니라 세포대사와 아폽토시스를 조절하는데서 결정적인 역할을 한다. IGF-1에 대한 유전자공학적연구가 활발히 진행되여 1980년대부터 본격적으로 생산되기 시작하였다. IGF-1은 성장호르몬비감수성질병과 인슐린저항성당뇨병의 치료약물로 판매되고있으며 그 응용분야가 계속 확대되고있다. IGF-1은 일반적으로 대장균발현계를 리용하여 생산하는데 후처리공정이 복잡하므로 가격이 비싸고 치료원가가 많이 드는것으로 하여 림상실천에 널리 적용되지 못하고있다.
최근 20년동안 메타놀동화효모(Pichia pastoris)에 의한 유용물질생산기술이 빠른 속도로 발전하여 생물제약분야에서 관건적인 주요기술의 하나로 되고있다. 메타놀동화효모발현계는 가장 널리 리용되는 외래유전자발현계들중의 하나로서 다른 발현계들에 비하여 목적단백질의 발현과 대량생산에서 많은 우점을 가지고있으며 적지 않은 연구자들이 우선적으로 선택하는 발현계로 되고있다.
우리는 사람인슐린양성장인자-1(hIGF-1)을 효모 Pichia pastoris에서 발현시킬것을 목적으로 효모에서 리용률이 높은 유전암호를 고려하여 유전자를 합성하고 클론화한데 기초하여 클론화한 유전자와 효모발현운반체인 pPIC9K의 재조합발현운반체를 제작하였으며 형질전환을 진행하여 hIGF-1의 효모발현계를 구축하였다.
hIGF-1유전자는 NCBI의 GenBank에 등록된 IGF-1의 유전자배렬(등록번호 CR541861)에 기초하여 hIGF-1의 전체 cDNA배렬에서 성숙펩티드암호화령역을 P.pastoris에서 리용률이 높은 유전암호로 유전암호치환을 진행하고 전문기관에 의뢰하여 합성하였다. 합성한 유전자가 들어있는 플라즈미드(pUC57-IGF-1)를 주형으로 하여 유전자단편을 증폭하고 pGEM®-T easy vector에 클론화하였다.
pGEM®-T easy vector에 클론화한 DNA단편은 258bp의 크기를 가지는 77개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드사슬을 암호화하며 말단에는 재조합에 리용할수 있는 EcoRI, NotI 제한효소인식배렬을 가지고있다.
다음으로 pGEM®-T easy vector에 클론화한 hIGF-1유전자를 효모발현운반체 pPIC9K와 재조합하고 전기천공법으로 발현숙주인 Pichia pastoris GS115에 형질전환하였다. PCR분석과 게네티신을 리용하여 다코피양성균그루를 선발하였으며 1% 메타놀유도배양후 얻은 배양상청에 대한 트리신 SDS-PAGE분석을 통하여 7.5kDa의 크기를 가진 목적단백질이 발현된다는것을 확인하였다.
우리가 육종한 재조합효모균그루의 rhIGF-1의 발현량은 진탕플라스크배양에서 15mg/L로써 선행문헌에서 언급된 자료보다 더 높다고 할수 있으며 이것은 고밀도배양에 의한 rhIGF-1의 대량생산을 위한 확고한 토대로 된다.
