Bci528I는 Bacillus circulans 528에서 분리한 Ⅱ형제한효소이다.
이 균그루는 토양에서 분리하여 1.5% 박토펩톤, 0.5% 박토효모엑스, 0.5% NaCl배지(37℃)에서 26h동안 배양하였다. 균체를 모으고 초음파마쇄하여 얻어진 무세포추출물을 세파덱스 G-150, DEAE-섬유소, CB-세파로즈 6B 탑에서 크로마토그라프를 진행하여 제한효소 Bci528I를 정제하였다.
Bci528I의 최적반응조건은 37℃에서 10mmol/L Tris HCl, pH 7.6, 10mmol/L MgCl2, 7mmol/L β-메르갑토에타놀, 50mmol/L NaCl이다.
제한효소 Bci528I의 인식배렬은 λ-DNA를 Bci528Ⅰ로 절단하여 얻어진 분해산물을 전기영동하여 검토하였다. 제한효소 Bci528I의 전기영동상은 EcoRI로 절단한 λ-DNA 의 전기영동상과 일치하였다.(그림 1) 이것은 제한효소 Bci528I가 헥사누클레오티드배렬5'-GAATTC-3'를 인식한다는것을 의미한다.
그림 1. Bci528I와 EcoRI의 인식배렬비교
1: λ-DNA
2: λ-DNA+Bci528I
3: λ-DNA+EcoRI
4: λ-DNA+EcoRI+Bci528I
Bci528I의 절단부위는 쌩거의 형광색소표식디데옥시법에 의하여 결정하였다.(그림 2)(1) 이 결과들은 Bci528I가 배렬5'-G↓AATTC-3'를 인식하고 인식배렬의 G와 A사이를 절단하여 상보적인 5'-테트라누클레오티드부착말단을 형성하는 제한엔도누클레아제이라는것을 보여준다.
그러므로 제한효소 Bci528I은 EcoRI의 진짜동위효소이다.(2)
Bci528I는 국제제한효소자료기지《REBASE》에 효소번호 18749로 등록되였다.
1) M13 정방향배렬을 리용한 분석결과
2) M13역방향배렬을 리용한 분석결과
그림 2. Bci528I의 절단부위
형광색소디데옥시누클레오티드법에 의한 배렬분석에는 pGEM-3Zf(+)와 합성프라이머를 리용하였다.
M13의 정방향프라이머: TGTAAAACGACGACGGCCAGT
M13의 역방향프라이머: CAGGAAACAGCTATGACC
참고문헌
1) Sanger F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 12, 5463.
2) Robert R.J et al. (2010) Nucl. Acids res. 38, D234.
