《과학연구사업을 더욱 강화하여 세포공학과 유전자공학, 초고압물리학, 극저온물리학을 발전시키며 레이자와 플라즈마기술, 원자에네르기와 태양에네르기를 개발하여 인민경제에 받아들이는데서 나서는 과학기술적문제를 적극 풀어나가야 하겠습니다.》 (
피틴태린의 리용률을 높여주는 피타제를 축산분야에 광범히 리용하기 위해서는 공업적인 대량생산을 실현하여야 한다. 그러자면 응용목적에 알맞는 피타제유전자를 클론화하는것과 함께 유전자공학적방법으로 그것의 재조합발현계를 구축하여야 한다. 우리는 대장균피타제유전자(appA)를 클론화한데 이어 대량발현을 위한 발현체계를 구축하고 재조합피타제의 생성량을 검토하기 위한 연구를 진행하였다.
먼저 클론화된 Escherichia coli 38 유래의 피타제유전자 appA(GenBank 등록번호 KT731135)의 전길이암호화배렬을 발현운반체 pET28 a(+)에 재조합하기 위한 프라이머를 설계하고 전문기관에 의뢰하여 합성하였다. 이때 방향성삽입을 위한 제한효소로는 BamHI와 HindIII을 리용하였으며 얻어진 재조합플라즈미드에 대한 유전자검정과 배렬분석을 통하여 유전자조작의 정확성을 확인한 다음 발현숙주 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켜 재조합균 E. coli BL21(pET-28a–appA)를 육종하였다.
재조합균주에 대한 젖당유도배양을 진행한 후 배양산물에 대한 피타제활성검토와 SDS-PAGE분석을 통하여 목적하는 크기(45kDa)의 대장균피타제가 정확히 발현되며 그것의 생성량은 유도제에 의하여 급격히 높아진다는것을 확인하였다.
피타제발현량을 높이기 위하여 유도제의 종류와 초기배양시간, 유도배양온도와 유도제의 농도, 유도시간의 영향을 검토하였다. 결과 하루밤동안 LB배지에서 배양한(37℃) 종균을 배지에 1% 접종하고 37℃에서 초기배양을 4h동안 진행한 다음 25℃에서 유도제로 8mmol/L 젖당을 리용하여 유도배양을 12h 진행하였을 때 피타제활성은 106.5U/mL였다. 이것은 유전자원천균 E. coli 38의 활성(0.33U/mL)의 300배이상에 해당한 높은 값이다.
선행한 재조합대장균의 피타제발현수준은 40~60U/mL이다. 우리가 육종한 재조합균주의 피타제발현활성은 appA를 효모에서 발현시킨것과 대등한 값으로서 높은 수준이며 고밀도세포배양을 적용하는 경우 높은 경제적효과성을 담보할수 있다.
